（干货分享）光学显微镜七种观察方式

发表时间：2023-12-14 00:34

光学显微镜是利用光学原理，把人眼所不能分辨的微小物体放大成像，以供人们提取微细结构信息的光学仪器。由于样品存在差异性，采用一样的观察方式观察不同样品，往往无法达到理想的成像。因此，针对不同的样品，选择不同的观察方式，成像问题就能迎刃而解。那么，常见的显微镜观察方式都有哪些呢？一起来看看吧

01明场（Bright-field-BF）

明场显微镜是所有光学显微镜照明技术中最简单的一种。样品照明是透射的（即从下方照亮并从上方观察）白光，并且样品中的对比度是由透射光在样品的密集区域中衰减引起的。明场显微镜是用于在光学显微镜中照明样品的一系列技术中最简单的一种。明场显微镜图像的典型图样是明亮背景上的深色样品，因此得名。

02 荧光（Fluorescence Field-FL)

荧光观察是小伙伴们最常用的观察模式。那么什么是荧光呢？即物质中的电子吸收光能由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。简言之，就是物质吸收短波光发射出的长波光。其特点是要有吸收光，即一定要有激发光源；荧光波长＞激发波长；还有荧光的强度要小于激发光的强度。荧光的强度主要取决于三大类：被检物浓度、荧光效率和激发光强度。其具有独特的优点：高特异性-靶向标记；对细胞刺激小-活体染色；能进行多重染色-共定位。多用于定位，定性，定量的研究。

03 相差（Phase contrast-Ph)

相差观察也是显微观察常用的方式之一，其需要配合特殊的相差物镜。原理是利用被检物体的光程（折射率x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能够比较清楚的观察到一些细微结构。

04 微分干涉（Differential Interference Contrast-DIC) 微分干涉的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。DIC利用的是偏振光，透射式DIC显微镜有四个特殊的光学组件：偏振器（polarizer）、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。DIC显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。

05 暗场（Dark Field-DF）

暗场成像与明场成像相对应，顾名思义，人不会直接观察到照明光线，而是光线斜射到标本的表面，根据丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光进行反射或衍射，增大了人眼可见性，我们才能够观察到极其微小的物体，那么如何实现暗场成像呢？透过显微镜剖面图，我们可以看到，聚光镜以高度角将一个光锥对准标本，这样部分光线就不会直接进入物镜。通过标本的光被光学不连续物(如细胞膜、细胞核和内部的细胞器)衍射、反射和折射，再次进入物镜，然后该样品就可以被看作是在黑色背景上的一个明亮的物体。

透射暗场观察的标本图像：水蚤，寄生虫，水蜗牛，花粉粒

反射光暗场能够反映样品表面的超微小结构，能够观察到小至0.004um的结构。但由于微小结构对于光散射或衍射的原因，暗场下并不能够进行准确的测量，所以暗场仅适合观察，用于一些超微小结构和缺陷的定位。当然，反射光暗场也有另外一个小用途，可以获取透明或半透明材料的颜色，如PCB板的绿油，铁锈的颜色等等。

06 偏光(POL)

偏光显微镜是利用光的偏振特性对具有双折射性物质进行研究鉴定的必备仪器，可做单偏光观察，正交偏光观察，锥光观察。将普通光改变偏振光进行镜检的方法，以鉴别某一物质是单折射（各向同性）或双折射性（各向异性）。双折射性是晶体的基本特征。因此，偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域。在人体及动物学方面，常利用偏光显微术来鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等。

07 霍夫曼调制相衬(HMC)

霍夫曼调制相衬是利用斜射光照射，他将相位梯度转变为光强度变化，这样可以用来观察未经染色的样品和活细胞。它的系统通常包括一个带狭缝的聚光镜，聚光镜里还有一个可以旋转的起偏器。它适用于相位物体、双折射物体、染色试样、柱状物体以及具有表面和次表面特征的物体进行高分辨率显微观察，可对细胞组织、透明液态组织、培养皿中的培养组织进行动态显微观察及科研分析。

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